轉(zhuǎn)錄因子（Transcriptionfactor，TF)是一種能與特異DNA序列結(jié)合的蛋白，可以單獨或與其他蛋白形成復(fù)合體，提高或阻斷特定基因?qū)NA聚合酶的招募，調(diào)控基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子的特點是它包含一個或多個DNA結(jié)合域（DNA-binding domain，DBDs），通過這些結(jié)合域與基因附近的DNA序列結(jié)合，從而完成調(diào)控。下面結(jié)合文章介紹轉(zhuǎn)錄因子的研究方法。

01、案例文章簡介

案例文章：

Ahr-Foxp3-RORt axis controls gut homing of CD4+T cells by regulating GPR15. Sci Immunol. 2020, 5(48). （IF=13.44）

GPR15是一種趨化因子受體，在T細(xì)胞向大腸歸巢的過程中發(fā)揮重要作用。這項研究發(fā)現(xiàn)小鼠大腸Treg中的GPR15表達(dá)水平最高，芳香烴受體（Ahr）可通過增加GPR15的表達(dá)促進(jìn)Treg向大腸的歸巢，而Foxp3及RORγt在Ahr介導(dǎo)的GPR15表達(dá)上調(diào)中分別起到正向及負(fù)向調(diào)控作用。另外，在人結(jié)腸Treg中也可重復(fù)上述發(fā)現(xiàn)。該研究提示，Ahr-Foxp3-RORγt軸可通過調(diào)控GPR15的表達(dá)調(diào)節(jié)Treg的腸道歸巢，從而影響腸道免疫穩(wěn)態(tài)。

02、案例文章的研究內(nèi)容

GPR15在小鼠大腸Treg中表達(dá)量最高，并且受Ahr控制。GPR15是一種孤兒鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白（G蛋白）偶聯(lián)趨化劑受體（GPCR），最初是基于其與其它GPCR家族成員的相似性而被發(fā)現(xiàn)的，也被稱為HIV或猿猴免疫缺陷病毒共受體。最近有研究表明，GPR15對小鼠和人的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和效應(yīng)T細(xì)胞（Teff）的腸道歸巢至關(guān)重要。芳香烴受體（Ahr）是一種環(huán)境傳感器，可檢測外源性配體，如環(huán)境毒素（如二惡英），以及宿主細(xì)胞、微生物群和飲食（如色氨酸代謝物）產(chǎn)生的內(nèi)源性配體。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測GPR15蛋白在各種T細(xì)胞中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Treg中GPR15的表達(dá)水平最高。在Ahr缺陷小鼠的CD4+ T細(xì)胞中，GPR15的表達(dá)水平降低。而在在Ahr過量表達(dá)小鼠的CD4+ T細(xì)胞中，GPR15的表達(dá)水平升高。

Ahr通過直接與Gpr15基因座結(jié)合調(diào)節(jié)GPR15表達(dá)。利用ChIP-seq在iTreg 和TH17細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Gpr15基因是Ahr最重要的全基因組靶點之一。Ahr在Gpr15基因座具有兩個實質(zhì)性的結(jié)合峰（在距轉(zhuǎn)錄起始點+15和+17 kb處）。

Foxp3與Ahr協(xié)同作用，正調(diào)節(jié)GPR15的表達(dá)。在CD4+ T 細(xì)胞中用shRNA干擾Foxp3，GPR15的表達(dá)水平降低。在來自Ahr+/+小鼠的iTregs細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)Foxp3可顯著提高其GPR15的表達(dá)，在來自Ahr-/-（Ahr缺陷）小鼠的iTregs細(xì)胞中卻沒有這種效果。在TH0條件下培養(yǎng)的分選CD4+T細(xì)胞中同時表達(dá)Ahr和WT Foxp3或Foxp3△FKH可以增加GPR15的表達(dá)，而Foxp3單獨表達(dá)并不影響GPR15的表達(dá)。ChIP-qPCR表明Foxp3在Gpr15基因座的結(jié)合位點與Ahr相同（距轉(zhuǎn)錄起始點+15和+17 kb處）。Ahr缺陷不影響Foxp3在Gpr15位點的結(jié)合，但是在iTreg中敲低Foxp3后，Ahr向Gpr15基因座的招募減少。

RORγt負(fù)向調(diào)節(jié)GPR15表達(dá)。在RORγt缺陷Treg中，GPR15的表達(dá)增加。RORγt和GPR15表達(dá)的負(fù)相關(guān)系在Ahr充足和Ahr缺陷Treg中都很明顯。此外，與來自RORγt充足的CD4+ T細(xì)胞分化的iTregs和TH17細(xì)胞相比，來自RORγt缺陷的CD4+ T細(xì)胞具有更高的GPR15表達(dá)。

RORγt拮抗Ahr在Gpr15基因座的DNA結(jié)合。在從RORγt缺陷小鼠分化的iTregs或TH17細(xì)胞中，Gpr15基因座的Ahr募集顯著增強(qiáng)，而在沒有Ahr的情況下，Gpr15基因座的RORγt結(jié)合顯著增加，提示Ahr和RORγt與Gpr15基因座結(jié)合存在競爭。此外在RORγt缺陷iTregs中表達(dá)RORγt抑制GPR15表達(dá)。

?Ahr通過調(diào)節(jié)GPR15促進(jìn)Tregs向腸道歸巢。在大腸（LI）和小腸（SI）中，歸巢的Ahr缺陷iTreg相對于WT對照組減少了大約三倍。GPR15的強(qiáng)制表達(dá)顯著增強(qiáng)了Ahr缺陷Treg向LI的歸巢，但不增強(qiáng)到包括SI在內(nèi)的其他器官的歸巢，這與GPR15在Treg大腸歸巢中的關(guān)鍵作用一致。此外， 在LI中WT-iTreg和GPR15恢復(fù)表達(dá)的Ahr缺陷iTreg的歸巢能力相當(dāng)（而不是在SI中），這表明GPR15在Ahr缺陷iTregs中的表達(dá)受損是其向LI歸巢缺陷主要機(jī)制。在Ahr缺陷的iTregs中強(qiáng)制表達(dá)GPR15促進(jìn)其在炎癥期間歸巢至LI。此外，強(qiáng)制表達(dá)GPR15的Ahr缺陷iTreg的過繼性轉(zhuǎn)移顯著抑制了腸道炎癥，表現(xiàn)為減輕了腸道組織學(xué)變化和降低了促炎細(xì)胞因子（即Tnf和Il1b）的表達(dá)。

Ahr信號促進(jìn)GPR15在人Treg中表達(dá)。與之前的報告顯示GPR15在人類Treg中的低表達(dá)不同，本研究檢測到GPR15在所有患者樣本中的表達(dá)。與外周血單個核細(xì)胞（PBMCs）相比，結(jié)腸Treg的 GPR15表達(dá)顯著增高。人Treg中Ahr mRNA表達(dá)的增加與Gpr15表達(dá)的增加以及其他Ahr靶基因（Cyp1a1和Ahrr）的表達(dá)增加有關(guān)，這與Ahr促進(jìn)Gpr15表達(dá)的作用相一致。此外，通過蛋白質(zhì)染色分析GPR15和Foxp3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Foxp3的表達(dá)與人CD127-CD25+ T細(xì)胞中GPR15的表達(dá)呈正相關(guān)。加入Ahr的配體FICZ顯著增強(qiáng)了iTreg中GPR15和其他Ahr靶基因的表達(dá)，但不增強(qiáng)Ahr的表達(dá)，而用一種特異性Ahr拮抗劑CH223191治療可消除人iTregs中GPR15的表達(dá)。

03、轉(zhuǎn)錄因子研究的技術(shù)手段

? 雙螢光素酶實驗

某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實現(xiàn)非共價結(jié)合，從而對基因的表達(dá)起增強(qiáng)或抑制的作用。雙螢光素酶報告實驗（dual luciferase assay）是檢測轉(zhuǎn)錄因子和靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段，通過檢測轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的改變對熒光素酶基因表達(dá)水平的影響，分析轉(zhuǎn)錄因子能否作用于啟動子。

其原理簡述如下：

（1）構(gòu)建一個將靶啟動子的特定片段插入到螢光素酶編碼序列上游的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。

（2） 將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)質(zhì)粒、干擾質(zhì)?；蛘遱iRNA與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。通常會用另一種螢光素酶作為內(nèi)參，避免轉(zhuǎn)染效率對實驗結(jié)果的影響。

（3） 加入特定的螢光素酶底物，螢光素酶與底物反應(yīng)，發(fā)光，通過檢測發(fā)光強(qiáng)度可以測定螢光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與靶啟動子片段有作用。

? 染色質(zhì)免疫共沉淀

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù) (chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)被廣泛用于研究體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子上特異性核苷酸序列的結(jié)合，并已成為研究染色質(zhì)水平基因表達(dá)調(diào)控的最有效的方法。ChIP的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白-DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長度的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA 片段。通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。通過qPCR或二代測序，篩選與目的蛋白互作的DNA信息。ChIP-PCR用于鑒定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到靶基因的啟動子上，而ChIP-seq用于篩選轉(zhuǎn)錄因子直接結(jié)合的靶基因，探究轉(zhuǎn)錄因子的作用元件。

? 電泳遷移率改變試驗

電泳遷移率改變試驗 (electrophoretic mobility shift assay，EMSA ) 也稱凝膠阻滯試驗，DNA 在凝膠中的遷移率與相對分子質(zhì)量及構(gòu)型有關(guān)。裸露DNA與含有結(jié)合蛋白的DNA- 蛋白質(zhì)復(fù)合物電泳時，裸露 DNA 遷移率主要取決于DNA本身，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物由于體積較大而滯留在較后位置。電泳遷移率改變試驗用于體外分析轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子的結(jié)合。將一系列序列不同的DNA片段與轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行電泳遷移率改變試驗，可以探究轉(zhuǎn)錄因子的體外結(jié)合序列。