m6A研究思路又來了，今天解讀一篇發(fā)表在Molecular Cancer（IF：15.3）上題為“RNA demethylase ALKBH5 prevents pancreatic cancer progression by posttranscriptional activation of PER1 in an m6A-YTHDF2-dependent manner”的文章。

01??前言

胰腺癌(PC)是一種起病隱匿、早期診斷困難、手術(shù)切除率低的胃腸道高惡性腫瘤，是世界上最常見的致命腫瘤之一?；颊叩?年生存率僅為8%，在發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移后甚至降至3%。因此，迫切需要闡明PC的分子和細胞機制，以達到診斷和治療干預的目的。N6-methyladenosine (m6A) 是真核生物mRNA中最豐富的可逆甲基化修飾，在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。本研究旨在探討m6A去甲基化酶的作用ALKBH5與胰腺癌(PC)的關系。

02??研究結(jié)果

? ALKBH5表達減少對PC具有預測和預后價值

作者首先檢測了42例胰腺腫瘤和相應非腫瘤性胰腺組織中ALKBH5的表達水平，發(fā)現(xiàn)與非癌對照組織相比，ALKBH5表達水平在PC中顯著下調(diào)；同時，在腫瘤組織中，發(fā)現(xiàn)m6A水平的上調(diào)；通過臨床結(jié)果分析，ALKBH5的低表達與患者的低生存率顯著相關。這些結(jié)果提示ALKBH5的下調(diào)可能與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展有關。

? ALKBH5在轉(zhuǎn)錄組調(diào)控的基礎上表現(xiàn)出抑癌活性

接下來，為了進一步探究ALKBH5在胰腺癌中的作用，作者在BxPC-3細胞中穩(wěn)定過表達ALKBH5，然后進行轉(zhuǎn)錄組測序（BxPC-3/vector cells (Control) and BxPC-3/Lv-ALKBH5 cells (ALKBH5 overexpression)），RNA-Seq分析顯示，與對照組細胞相比，在ALKBH5過表達的PC細胞中，共有367個差異表達基因 (204個上調(diào)基因，163個下調(diào)基因)，其中顯著上調(diào)的基因有PER1，F(xiàn)OXO1，CDC20，CCR5等。GO分析發(fā)現(xiàn)，細胞周期阻滯，抗增殖和凋亡等相關基因在ALKBH5過表達后特異性上調(diào)，而與細胞存活和增殖相關的基因顯著下調(diào)。同時，KEGG通路分析顯示，與細胞周期和生長密切相關的PI3K-AKT和P53信號通路顯著激活。

? ALKBH5抑制PC細胞的增殖、遷移和侵襲

接下來，作者進一步明確ALKBH5在胰腺癌中的作用。首先在胰腺癌細胞系中構(gòu)建了ALKBH5敲降和過表達穩(wěn)定細胞株，然后通過CCK8、克隆形成、EDU染色、流式等一系列實驗證實過表達ALKBH5可以抑制胰腺癌細胞增殖；同時，劃痕和Transwell實驗顯示過表達ALKBH5可以抑制胰腺癌細胞遷移和侵襲；與此相反，敲降ALKBH5會顯著促進細胞增殖、遷移和侵襲。

? ALKBH5抑制PC動物模型的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移

在細胞水平證實了ALKBH5的作用后，作者進一步在動物水平進行驗證。通過構(gòu)建ALKBH5敲降和過表達穩(wěn)定細胞株、皮下異種移植、原位異種移植、穩(wěn)定表達熒光素酶體內(nèi)成像、免疫組化等實驗，證明了ALKBH5抑制PC動物模型的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，與細胞實驗驗證結(jié)果一致。

? ALKBH5通過靶向PER1調(diào)控PC

在體內(nèi)體外實驗中明確了ALKBH5的作用后，作者繼續(xù)探究具體作用機制。首先通過RNA-Seq和m6A-Seq聯(lián)合分析確定了PER1是ALKBH5下游靶標，并且，PER1 mRNA的m6A修飾位點上有m6A讀取蛋白YTHDF2的結(jié)合位點。

? ALKBH5以m6A-YTHDF2依賴的方式增加PER1 mRNA水平

隨后，作者在ALKBH5敲降和過表達穩(wěn)定細胞株中，通過qPCR、MeRIP-qPCR、熒光素酶等實驗，證明了ALKBH5以m6A-YTHDF2依賴機制調(diào)控PER1的表達。

? ALKBH5在PC組織中與PER1表達相關，具有抑瘤作用

接著作者利用臨床樣本及TCGA數(shù)據(jù)集分析和免疫熒光驗證說明PER1與臨床胰腺癌患者的ALKBH5表達呈正相關。接著，作者通過 CCK-8、EdU and transwell 等回復實驗，發(fā)現(xiàn)異位表達的PER1抑制了PC的進展，部分挽救了ALKBH5敲降導致的胰腺癌細胞增殖和侵襲的異常。最后，作者進一步發(fā)現(xiàn)異位表達的PER1水平可導致ATM依賴信號通路的激活，p-ATM、p-CHK2、p-CDC25C、pP53、P21和p-CDK1蛋白水平上調(diào)，并且免疫共沉淀實驗證明了ATM和PER1具有相互作用。

? PER1誘導的P53激活ALKBH5轉(zhuǎn)錄

以上實驗其實就是一篇比較完整的文章了，但作者對機制實驗進一步深入探究。研究發(fā)現(xiàn)，p53的異位表達，使得胰腺癌細胞ALKBH5水平顯著升高；同時，免疫熒光染色顯示P53的表達降低了BxPC-3細胞總RNA中m6A的水平。隨后，通過Chip、熒光素酶等實驗證實了，p53可以通過與ALKBH5的啟動子結(jié)合激活其轉(zhuǎn)錄。最后，TCGA數(shù)據(jù)集分析還發(fā)現(xiàn)，p53野生組中ALKBH5水平較高，而p53突變組中ALKBH5水平較低。

總結(jié)

ALKBH5缺失與胰腺癌臨床病理特征差及預后不良有關。過表達ALKBH5可降低PC細胞的增殖、遷移、侵襲和腫瘤的生長，而ALKBH5敲降促進PC進程。PER1 mRNA的去甲基化及其水平的升高是ALKBH5以m6A-YTHDF2依賴的方式發(fā)揮作用。PER1誘導的p53上調(diào)和p53激活的ALKBH5轉(zhuǎn)錄可能反映了PC m6A修飾的反饋調(diào)控。

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